Yokoi tốt nghiệp Đại học Doshisha với vi bằng ngành điện tử. Ông làm việc cho Nintendo từ năm 1965, công việc chính là nhân vật bảo trì dây chuyền lắp ráp máy dùng để sản xuất thẻ bài hanafuda của hãng.[2]

Năm 1966, chủ tịch của Nintendo vào thời điểm đó là Yamauchi Hiroshi đã đến một nhà máy hanafuda nơi Yokoi đang làm việc và chú ý đến một món đồ chơi, một cánh tay kéo dài mà Yokoi đã làm để giải trí lúc rảnh rỗi. Yamauchi đã ra lệnh cho Yokoi phát triển nó như một sản phẩm phù hợp cho mùa Giáng sinh. Ultra Hand đã thành công rực rỡ và Yokoi được yêu cầu làm thêm các đồ chơi khác của Nintendo, bao gồm trò giải đố Thùng mười tỷ, một máy hút bụi điều khiển từ xa thu nhỏ có tên là Chiritory, một máy ném bóng chày được gọi là Ultra Machine, và "Love Tester". Ông vẫn làm đồ chơi cho đến khi công ty quyết định sản xuất trò chơi điện tử vào năm 1974,[3] khi ông trở thành một trong những nhà thiết kế trò chơi đầu tiên, chỉ sau Takeda Genyo.[4]

Khi đang đi trên tàu cao tốc (Shinkansen), Yokoi nhìn thấy một nhân vật văn phòng có vẻ buồn chán, đang chơi với máy tính bỏ túi có màn hình LCD, bằng cách nhấn các nút. Sau đó, Yokoi đột nhiên có ý tưởng về một chiếc đồng hồ một công đôi chuyện, như một trò tiêu khiển thu nhỏ[5] và tiếp tục tạo ra Game & Watch, một dòng máy điện tử cầm tay minigame hoạt hình có màn hình LCD đơn giản, phát hành từ năm 1980 đến năm 1991 và có 60 biến thể.

Năm 1981, Yamauchi chỉ định Yokoi giám sát Donkey Kong, một máy game thùng do Miyamoto Shigeru tạo ra.[6] Yokoi đã giải thích nhiều điểm phức tạp của thiết kế trò chơi cho Miyamoto khi ông mới bắt đầu sự nghiệp và dự án chỉ được phê duyệt sau khi Yokoi trình bày ý tưởng trò chơi của Miyamoto với tổng giám đốc.[7]

Sau thành công toàn cầu của Donkey Kong, Yokoi tiếp tục hợp tác với Miyamoto trong game Mario tiếp theo là Mario Bros.[7] Ông đã đề xuất khái niệm nhiều người chơi và thuyết phục đồng nghiệp thêm cho Mario một số khả năng siêu phàm, chẳng hạn như khả năng nhảy từ độ cao lớn mà không bị mất mạng.[7]

Sau Mario Bros., Yokoi đã sản xuất một số trò chơi R&D1, chẳng hạn như Kid Icarus và Metroid.[8] Ông thiết kế R.O.B.[9] và Game Boy, sau này đã trở thành một thành công trên toàn thế giới.[8] Một sáng tạo khác của ông là Virtual Boy nhưng gặp thất bại về mặt thương mại.

Nintendo phủ nhận hiệu suất bán kém của Virtual Boy trên thị trường là lý do khiến Yokoi rời công ty sau đó,[10] họ cho rằng việc nghỉ hưu của ông là "hoàn toàn ngẫu nhiên" đối với hiệu suất thị trường đối với bất kỳ phần cứng nào của Nintendo.[11] Theo Taki Yoshihiro, đồng nghiệp ở Nintendo và Koto, ban đầu Yokoi đã quyết định nghỉ hưu ở tuổi 50 để làm những gì mình thích nhưng chỉ đơn giản là trì hoãn nó.[12] Theo cuốn sách Game Over của David Sheff, Yokoi chưa bao giờ thực sự có ý định phát hành máy chơi game ở dạng hiện tại. Tuy nhiên, Nintendo đã đẩy Virtual Boy ra thị trường để có thể tập trung nguồn lực phát triển vào Nintendo 64.[13]

Giữa sự thất bại của Virtual Boy và màn ra mắt của Game Boy Pocket thành công hơn, Yokoi rời Nintendo vào ngày 15 tháng 8 năm 1996 sau 31 năm làm việc tại công ty. Cùng với một số cấp dưới, ông nghĩ việc và thành lập một công ty mới tên là Koto, Yokoi đã giúp tạo ra Tamagotchi và trở thành trưởng nhóm phát triển máy chơi game cầm tay WonderSwan của Bandai.[14][15]